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Gaetano Odierna » 3.Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica


Problematica per l’osservazione dei preparati biolgici

L’osservazione al microscopio ottico o elettronico dei campioni biologici richiede che i preparati siano sufficientemente sottili da risultare trasparenti al fascio di luce o di elettroni e che sia preservata la morfologia delle cellule e degli organelli in esse contenuti.

Tecnica delle fette

In microscopia ottica il procedimento comunemente in uso per l’allestimento dei preparati è la “tecnica delle fette” di campioni inclusi in paraffina. La tecnica prevede i seguenti passaggi:

  1. prelievo organo;
  2. fissazione;
  3. lavaggio;
  4. disidratazione (tramite serie ascendente degli alcol);
  5. chiarificazione in solventi organici (xilene – Histolemon);
  6. inclusione in paraffina;
  7. sezioni al microtomo;
  8. distensione delle fette su vetrini;
  9. sparaffinatura in sol urefllss. louboutins en ofertaventi organici;
  10. idratazione delle fette tramite la serie discendente degli alcool;
  11. colorazione;
  12. disidratazione tramite serie ascendente degli alcool;
  13. chiarificazione;
  14. montaggio in balsamo (resine sintetiche).

Tecnica delle fette: prelievo e fissazione

1 – Prelievo: il prelievo dell’organo, solitamente di dimensioni al di sotto del cm3, va eseguito rapidamente, e se necessario, iniettando il fissativo via perfusione.

2 – Fissazione: ha lo scopo di bloccare la lisi delle cellule e dei tessuti e di preservarne il più possibile la struttura.


Tecnica delle fette: fissazione e disidratazione


Tecnica delle fette: inclusione in paraffina

6 – Inclusione in paraffina: viene effettuata in paraffina liquida, mantenuta a 60° in apposite stufe dove, preferibilmente, è possibile effettuare il vuoto.

Preparazione blocchetti: il campione è contenuto in paraffina liquida, contenuta in contenitori prestampati o in lamelle di rame. La paraffina è poi lasciata solidificare a temperatura ambiente per 24 ore.

Lamelle di rame
Blocchetti pronti per il taglio al microtomo

Tecnica delle fette: sezioni al microtomo

7 – Sezioni al microtomo Il Microtomo: è uno strumento che permette di ottenere fette del campione incluso in paraffina dello spessore di 3-10 μm.

8 – Distensione delle fette su vetrini: si ottiene mettendo le fette sulla superficie dell’acqua portata ad una temperatura tra i 40-50 °C.

Affettatura

Affettatura


Tecnica delle fette: colorazione e montaggio in balsamo

9 – Sparaffinatura in solventi organici: elimina la paraffina dalle fette.

10 – Serie discendente degli alcool e idratazione: viene effettuata gradualmente tramite passaggi in alcol a gradazione decrescente.

11 – Colorazione: può essere dicromica (emallume -eosina; prima immagine) o tricromica (ad esempio tricromica di Mallory; seconda immagine).

12 – Disidratazione: si effettuta tramite il passaggio dei vetrini nella serie ascendente degli alcool.

13 – Chiarificazione: si effettuata tramite il passaggio in solventi organici.

14 – Montaggio in balsamo: consiste nell’interporre uno strato di resina sintetica tra vetrino porta- e coprioggetti.

Colorazione dicromica (Emallume eosina)
Colorazione tricromica di Mallory
Colorazione

Tecnica delle fette in Microscopia elettronica

In linea di principio l’allestimento dei preparati biologici in microscopia elettronica segue gli stessi criteri della microscopia ottica. Tuttavia sono previsti importanti modifiche:

  • Prelievo: le dimensioni del campione sono di solito dell’ordine di 1-2 mm3. Il prelievo va effettuato a freddo in specifici tamponi.
  • Fissazione: è eseguita a freddo con fissativi chimici non coagulanti (es. paraformaldeide, gluteraldeide) a cui segue in genere la post-fissazione in tetrossido di osmio.
  • Inclusione: il campione viene incluso in plastica (resine epossidiche).
  • Sezioni: si usa l’ultramicrotomo con cui si possono ottenere sezioni ultrafini (80-100 nm). Si usano lame di vetro o di diamante montate su una bacinella con acqua. Le fette ottenute sono raccolte con un retino di rame.
  • Colorazione: si usano sali di metalli pesanti (opachi agli elettroni) ad esempio Sali di piombo, di platino, di oro, d’argento, etc.
Sezioni con l’ultra-microtomo e raccolta delle fette con il retino di rame

Sezioni con l'ultra-microtomo e raccolta delle fette con il retino di rame


Schema della Tecnica delle fette in Microscopia elettronica

Preparazione dei campioni per l’osservazione in microscopia elettronica. Fonte: G. Karp, Biologia Cellulare e Molecolare, Edises, II Ed. 2004

Preparazione dei campioni per l'osservazione in microscopia elettronica. Fonte: G. Karp, Biologia Cellulare e Molecolare, Edises, II Ed. 2004


Confronto tecniche delle fette in Microscopia ottica ed elettronica


Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica

Colorazione negativa – viene applicata soprattutto per lo studio dei virus e delle macromolecole*.

Il campione, sospeso in un colorante elettrondenso, è applicato su un retino ricoperto da un sottile film di plastica. Si asciuga all’aria e si osserva al TEM. Il colorante riempie gli spazi vuoti, che appariranno scuri, mentre i virus o le macromoleche risultano chiari.

* le tecniche di isolamento e purificazione delle macromolecole (glucidi, lipidi, proteine e acidi nucleici) saranno discusse in specifici corsi, quali ad esempio Biochimica. Consultare anche i capitoli delle tecniche nei libri di testo consigliati dal docente del corso.

Batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa

Batteriofago evidenziato tramite colorazione negativa


Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica II

Ombreggiatura al platino – è usato per lo studio delle macromolecole.

1) Il campione è adsorbito su un supporto liscio (lastra di mica). 2) Sotto vuoto spinto e sotto rotazione, sul campione viene proiettato, sotto un angolo di 5°-15°, un sottile strato di platino (elettron-denso) che evapora da un elettrodo al Platino reso incandescente. 3) Lo strato di platino, che rappresenta la replica della superficie del campione,  è stabilizzato da uno strato di carbone fatto cadere dall’alto da un elettrodo di  carbone (elettron-chiaro).  4) la replica di platino è prima trasferita in un bagno alcalino che degrada il campione e, quindi, dopo lavaggio, (5) è trasferita su un retino per l’osservazione al TEM (6).

Molecole di miosina ombreggiate al platino

Molecole di miosina ombreggiate al platino


Particolari tecniche in uso in microscopia elettronica III

Il freeze etching è una tecnica particolarmente usata per lo studio della struttura interna delle membrane cellulari e delle strutture cellulari interne. Il campione, opportunamente crioprotetto (1), è immerso in azoto liquido (2);  in tal modo l’acqua vetrifica. Il campione è immesso sotto vuoto e quindi è inciso da una lama (3). Il piano di frattura prezerenzialmente avviene lungo il doppio strato delle mambrane biologiche (4). La superficie esposta dalla frattura è poi ombreggiata al platino (5) e rinforzata da una strato di carbone. La sostanza organica del campione viene rimossa mediante digestione alcalina e la replica metallica dopo lavaggio è osservata al microscopio elettronico (6).


Particolari tecniche – metodo di purificazione degli organelli cellulari


Le lezioni del Corso

1. Livelli di organizzazione in Biologia - Storia della citologia

2. Principi e tecniche in microscopia

3. Allestimento di preparati biologici in microscopia ottica ed elettronica

4. Composizione chimica della cellula

5. Principali metodi istochimicici, immuno-istochimici, colture in vitro, autoradiografia

6. Sguardo d'insieme ai virus, alla cellula procariotica ed eucariotica

7. La membrana plasmatica

8. Fisiologia della membrana plasmatica

9. Citoscheletro: generalità e i microfilamenti

10. Citoscheletro: microtubuli e filamenti intermedi

11. Giunzioni cellulari e adesione cellulare

12. Ribosomi, smistamento proteine, reticolo endoplasmatico

13. Apparato di Golgi, Lisosomi

14. Esocitosi, Endocitosi, transcitosi

15. Perossisomi, Mitocondri

I materiali di supporto della lezione

G. Karp - Biologia Cellulare e Molecolare – Edises – II Edizione 2004

Esercitazioni

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C’è profonda coerenza anticristiana nella cacciata di Colombo dall’America

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settembre 12, 2017 Alfredo Mantovano

Vanno difese le statue dalla nuova iconoclastia. Ma se non cogliamo la ragione vera di questo odio, anche la nostra testolina, più o meno graziosa, corre rischi

statua colombo ansa

Articolo tratto dal numero di Tempi in edicola (vai alla pagina degli abbonamenti) – Per giustificare la demolizione o la decapitazione delle statue erette in onore di Cristoforo Colombo in numerose città degli Stati Uniti sono state mosse non poche imputazioni postume contro il navigatore genovese: nessuna ha il carattere della novità. Se si passa in rassegna solo un campione delle migliaia di monografie a lui dedicate, si trova di tutto, da ricostruzioni storicamente fondate, esito di ricerche rigorose, al parallelo fra lui e Adolf Hitler, avanzato dal Movimento indianista.

Si è avuta una fioritura di scritti non da poco un quarto di secolo fa, in occasione del quinto centenario della scoperta dell’America; in quella circostanza sulla rivista Cristianità (n. 203, marzo 1992), l’indimenticato medievista Marco Tangheroni e Maurizio Parenti pubblicarono un breve ma intenso saggio dedicato a Colombo. Val la pena rileggerlo (è pubblicato nel sito alleanzacattolica.org) perché i luoghi comuni di allora sono quelli di oggi; ma soprattutto perché aiuta a comprendere quale è la posta in gioco, culturale prima ancora che politica.

Fu un «incontro di due mondi»
Colombo, che – secondo un altro genovese che ha molto scritto su di lui, Paolo Emilio Taviani – fu «non santo, ma defensor fidei», non è né il capostipite di conquistatori assetati di schiavi né (vi è pure questo nella manipolazione della sua figura) l’emblema di una modernità che finalmente supera i pregiudizi dei cosiddetti secoli bui e anticipa le aperture dell’Illuminismo. Fu un navigatore di eccezionale valore, la cui perizia competeva con il coraggio e con la consapevolezza dell’arditezza del percorso via mare verso l’Oriente che intendeva intraprendere, come realmente fece. Ma, leggendo i suoi scritti, in particolare il Diario di bordo, e i documenti raccolti dai biografi più seri, si scopre una religiosità profonda, accompagnata dal rispetto per i popoli incontrati con la scoperta, fin dal primo contatto, il 12 ottobre 1492: «Conobbi che era gente che meglio si salverebbe e si convertirebbe alla nostra santa fede con l’amore che con la forza», scrive nel Diario, e il concetto non è così scontato per l’epoca.

Chi ha meritoriamente contrastato le rimozioni e gli oltraggi alle statue di Colombo lo ha fatto in nome della memoria storica e dei meriti oggettivi della scoperta del Continente americano, e delle prospettive che ha aperto. Ma è coerente con orientamenti pseudoculturali oggi egemoni che il genovese sia rimosso, che le sue immagini siano distrutte e il suo ricordo coperto d’infamia. Egli compie la sua impresa sotto l’egida dei re spagnoli: re cattolici che pochi mesi prima, il 2 gennaio 1492 con la presa di Granada, avevano completato la Reconquista iniziata sette secoli prima; re che lo avevano sostenuto nonostante la contrarietà dei loro consiglieri, che ritenevano l’impresa impossibile; che lo avevano fatto anche sulla scia dell’entusiasmo di una Spagna finalmente riunita sotto le insegne cristiane; e diventa con la sua impresa l’iniziatore di «quell’incontro di due mondi che ebbe luogo quando giunsero i primi spagnoli ed entrarono in contatto con i popoli indigeni» (Giovanni Paolo II, omelia a Salta, Argentina, 8 aprile 1987). Il suo viaggio oltreoceano costituisce in qualche modo lo sviluppo ardito che la cultura fino a quel momento maturata in Europa, che aveva prodotto cattedrali e summe, invenzioni e progressi della scienza, era pronta a estendersi nel resto del mondo, pur se con limiti ed errori, anche gravi e dolorosi. Uno sviluppo che trae slancio dalla pace ritrovata nella penisola iberica di antica fede cristiana per condurre tale fede a migliaia di miglia di distanza.

Se qualunque fede è un pericolo
E ci meravigliamo che Colombo sia odiato da un mondo per il quale la fede è mistificazione, superstizione, fastidio? Per il quale la coerenza tra la fede e la vita è pericoloso integralismo? Per il quale le imprese compiute in nome della fede rappresentano attentati all’umanità? Per il quale, poiché c’è chi radicalizza la propria confessione giungendo in suo nome alla violenza, ogni professione di fede è ostile all’uomo?

Vanno difese le statue dalla nuova iconoclastia, vanno rimesse a posto le loro teste mozzate, ma con la consapevolezza che se non cogliamo la ragione vera, ideologicamente anticristiana, di quest’odio, anche la nostra testolina, più o meno graziosa, corre rischi concreti. Non perché chi disprezza Colombo sia un omicida, ma perché vi è un filo rosso fra il ripudio di una Storia che è stata grande per quello che ha costruito e il nulla di cui abbiamo deciso di disporre per difenderci da chi le teste oggi le taglia per davvero.

Foto Ansa

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america cristianesimo Cristoforo Colombo statue

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Che cos'è "take a knee", perché i campioni americani si inginocchiano durante l'inno

27/09/2017  Hanno cominciato più di un anno fa i campioni di football americano, ma ora la protesta sta dilagando al baseball e alla pallacanestro Nba, colpa anche delle offese di Trump.

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Elisa Chiari

Tutto era cominciato un anno fa, nel football americano, uno dei quattro sport nazionali del Nord America (con baseball, hockey ghiaccio e pallacanestro Nba), quando nelle strade era montata la protesta per il caso di un ragazzo afroamericano disarmato ucciso dalla Polizia, mentre si era denunciato da più parti il grilletto facile contro gli afroamericani.

Alcuni giocatori, per protesta contro il razzismo strisciante, avevano cominciato ad ascoltare inginocchiati l'inno americano eseguito in occasione delle partite. Di qui il nome della protesta "take a knee", "inginòcchiati".

Il primo fu il quarterback dei San Francisco 49ers Colin Kaepernick, poco più di un anno fa, per denunciare la violenza della polizia verso gli afroamericani ed esprimere solidarietà al movimento 'Black Lives Matter' ("Le vite nere valgono"). Altri di lì hanno seguito il suo esempio soprattutto dopo i fatti di Charlottesville dove una donna era morta e molte persone erano rimaste ferite da un’auto lanciata contro la folla che protestava per il corteo dei cosiddetti “suprematisti bianchi”, che affermano la supremazia della razza ariana.

Ma è stato quando, pochi giorni fa durante un comizio, Donald Trump ha invitato le leghe sportive professionistiche a «licenziare quei... (qui un insulto triviale pronunciato per esteso, ndr.)  che si inginocchiano all’esecuzione dell’inno nazionale» che la protesta è dilagata davvero uscendo dai confini americani (si sono inginocchiati anche a Wembley), coinvolgendo i giocatori della pallacanestro Nba (si sono espressi LeBron James, Stephen Curry, Kobe Bryant), con i Warriors che hanno annunciato che non andranno alla Casa Bianca alla festa riservata ai campioni d’America, i giocatori di baseball che si sono uniti, finché squadre intere che hanno cominciato a inginocchiarsi per gli stadi d’America sottintendendo un «Licenziateci tutti». Il tutto con la solidarietà di dirigenti delle leghe sportive e di allenatori bianchi, da Steve Kerr a Gregg Popovic, che si sono schierati con i giocatori e di Stevie Wonder che si è inginocchiato, sul palco, durante un concerto. 

La protesta sta dilagando e la questione si sta spostando: la battaglia contro il razzismo sta diventando una battaglia per la libertà di espressione.

Tag:
baseball, football americano, Nba, protesta, sport, stati uniti, take a knee, trump
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Dal football all'Nba, che ci fanno i campioni americani si mettono in ginocchio per protesta
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